Kemampuan untuk memberi label molekul biologis secara efektif dengan tag fluoresen sangat mendasar bagi banyak bidang penelitian biologi. Fluorescein 5-isothiocyanate (FITC) adalah reagen yang sangat disukai untuk tujuan ini, terutama karena reaktivitasnya yang sangat baik dengan gugus amina. Panduan ini memberikan tinjauan praktis tentang konjugasi FITC, dengan fokus pada protokol kunci dan pertimbangan untuk mencapai hasil yang optimal.

Prinsip inti di balik konjugasi FITC melibatkan reaksi antara gugus isothiocyanate (-N=C=S) pada FITC dan gugus amina bebas (-NH2) yang ada pada protein, paling umum adalah gugus epsilon-amina residu lisin. Reaksi ini membentuk ikatan tiourea yang stabil. Memahami protokol pelabelan fluorescein 5-isothiocyanate sangat penting untuk memaksimalkan efisiensi pelabelan dan meminimalkan reaksi samping yang tidak diinginkan. Titik awal yang umum bagi peneliti yang ingin membeli pewarna FITC secara online adalah memastikan mereka memperoleh produk dengan kemurnian tinggi.

Saat melakukan konjugasi FITC ke antibodi atau protein lainnya, beberapa faktor memerlukan perhatian cermat. pH buffer reaksi sangat penting; pH basa ringan, biasanya antara 8,5 dan 9,5, optimal untuk mengekspos gugus amina tanpa mendenaturasi protein. Konsentrasi protein dan reagen FITC juga memainkan peran yang signifikan. Misalnya, konsentrasi protein dapat memengaruhi efisiensi pelabelan, dan seringkali direkomendasikan untuk bekerja dengan protein dalam kisaran 1-2 mg/mL. FITC biasanya disiapkan sebagai larutan stok dalam pelarut organik seperti DMSO atau DMF, dan konsentrasinya harus dikontrol dengan hati-hati untuk mencapai rasio molar yang diinginkan antara pewarna dan protein.

Menghitung jumlah FITC yang tepat untuk digunakan adalah hal terpenting. Rasio molar optimal FITC terhadap protein bervariasi tergantung pada protein spesifik dan intensitas pelabelan yang diinginkan. Untuk antibodi, rasio molar 5:1 hingga 10:1 (FITC terhadap antibodi) seringkali merupakan titik awal yang baik. Kelebihan FITC dapat menyebabkan pelabelan non-spesifik atau pemadaman fluoresensi, sedangkan FITC yang tidak mencukupi akan menghasilkan intensitas sinyal yang buruk.

Setelah reaksi konjugasi, yang biasanya terjadi di lingkungan gelap pada suhu kamar selama 1-2 jam, pemurnian sangat penting. FITC yang tidak bereaksi harus dihilangkan untuk mencegah noise latar belakang dalam pengujian selanjutnya. Metode pemurnian umum meliputi kromatografi eksklusi ukuran (SEC) menggunakan kolom seperti Sephadex G-25 atau dialisis terhadap buffer. Langkah ini sangat penting untuk mendapatkan konjugat yang bersih yang cocok untuk teknik sensitif seperti sitometri aliran dan imunofluoresensi.

Bagi mereka yang baru mengenal pelabelan FITC, memanfaatkan kit pelabelan protein FITC dapat menyederhanakan prosesnya. Kit-kit ini sering kali dilengkapi dengan reagen yang sudah diukur sebelumnya dan instruksi terperinci, memastikan pengalaman yang lebih efisien. Pada akhirnya, menguasai konjugasi FITC membuka pintu ke berbagai macam analisis biomolekuler, menjadikannya keterampilan yang patut dikembangkan bagi setiap peneliti ilmu hayati.