Aβ(1-42) для высокопроизводительного скрининга антиагрегационных соединений
Освоение сброса мономера перед анализом: протоколы частоты и амплитуды ультразвуковой обработки для Aβ(1-42) в высокопроизводительном скрининге антиагрегационных соединений
В высокопроизводительном скрининге (HTS) антиолигомерных соединений начальное состояние пептида Human Aβ42 имеет критическое значение. Любые предварительно существующие агрегаты могут исказить результаты, приводя к ложноотрицательным результатам или завышенным значениям IC₅₀. Мы рекомендуем строгий протокол мономеризации с использованием гексафторизопропанола (HFIP) с последующей точной ультразвуковой обработкой. Из нашего практического опыта следует, что распространенной ошибкой является недостаточная амплитуда ультразвуковой обработки, что оставляет за собой мелкие зародышевые центры, вызывающие преждевременную нуклеацию агрегации. Для типичного запаса 1 мг/мл в HFIP мы проводим ультразвуковую обработку в ультразвуковой бане на частоте 40 кГц с установкой амплитуды 60-80% в течение 10 минут при 4°C. После испарения и ресуспендирования в буферном растворе для анализа вторая кратковременная ультразвуковая обработка (5 минут, амплитуда 20%) обеспечивает однородное мономерное решение. Этот шаг особенно важен при использовании beta-Amyloid 1-42 в 384-луночных планшетах, где согласованность между лунками имеет первостепенное значение. Для тех, кто переходит от других поставщиков, наш β-amyloid polypeptide 42 ведет себя идентично в этих условиях, служа бесшовной заменой для Bachem amyloid β-protein (1-42).
Нейтрализация помех от следов металлов: стратегии хелатирования DTPA против EDTA для предотвращения агрегации вне пути в кинетических анализах длительностью до 72 часов
Следовые металлы, особенно Cu²⁺ и Zn²⁺, известны тем, что ускоряют агрегацию Aβ42 peptide и способствуют образованию олигомеров вне пути, что запутывает скрининг антиагрегационных соединений. В кинетических анализах длительной продолжительности (до 72 часов) даже наномолярные концентрации этих металлов могут изменить кинетику агрегации. Мы обнаружили, что диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA) превосходит EDTA в поддержании условий, свободных от металлов. DTPA имеет более высокое сродство к Cu²⁺ (log K = 21.5) по сравнению с EDTA (log K = 18.8), и она менее чувствительна к колебаниям pH. В нашей практике добавление 10 мкМ DTPA в буферный раствор снижает коэффициент вариации (CV) конечных точек флуоресценции ThT с 15% до менее чем 5% по всему 384-луночному планшету. Это критично при скрининге библиотек из 12 800 соединений, как описано в дрожжевом HTS для антиолигомерных соединений. Для тех, кто использует Amyloid beta 42 в бесклеточных анализах, мы рекомендуем предварительную обработку всех буферов смолой Chelex-100 и затем добавление DTPA. Эта практика обеспечивает то, что исследовательский реагент работает согласованно, партия за партией.
Контроль ионной силы буфера и микросмещения pH: обеспечение воспроизводимых значений IC₅₀ в долгосрочных исследованиях олигомеризации Aβ(1-42)
Состав буфера часто упускается из виду, но является основным источником межлабораторной изменчивости. Мы наблюдали, что небольшие изменения в ионной силе (например, 50 мМ против 150 мМ NaCl) могут сдвинуть время лага агрегации Aβ(1-42) на несколько часов. Для HTS мы стандартизируем на фосфатно-солевом буфере (PBS) при pH 7.4 с 150 мМ NaCl. Однако скрытой проблемой является микросмещение pH из-за поглощения CO₂ во время длительных инкубаций. Для борьбы с этим мы добавляем в буфер 10 мМ HEPES и герметизируем планшеты газопроницаемыми мембранами. Это поддерживает pH в пределах 0.1 единиц в течение 72 часов. При валидации новой партии Human Aβ42 мы всегда проводим анализ с эталонным ингибитором (например, эпигаллокатехин галлат) для подтверждения того, что IC₅₀ попадает в исторический диапазон. Наш исследовательский реагент Aβ(1-42) высокой чистоты стабильно дает IC₅₀ 2.5 ± 0.3 мкМ для EGCG в этой стандартизированной буферной системе.
Валидация бесшовной замены: согласование согласованности партий Aβ(1-42) для бесшовной интеграции в существующие платформы скрининга антиолигомеров
Для руководителей R&D смена поставщика пептидов может быть рискованной. Мы обеспечиваем, что наш beta-Amyloid 1-42 является истинной бесшовной заменой, придерживаясь строгого контроля качества. Каждая партия тестируется в стандартизированном анализе агрегации ThT и должна демонстрировать время лага 45 ± 5 минут и конечную интенсивность флуоресценции в пределах 10% от эталонной партии. Кроме того, мы предоставляем подробный сертификат анализа (COA), включающий чистоту по HPLC (>95%), идентификацию по масс-спектрометрии и уровни эндотоксинов. Для тех, кто использует дрожжевой HTS для антиолигомерных соединений, наш пептид был валидирован на образование SDS-стабильных олигомеров низкого n, которые нарушают активность фактора высвобождения Sup35p, как и ожидалось. Эта согласованность партий означает, что вы можете интегрировать наш Aβ42 peptide в ваш существующий каскад скрининга без необходимости повторной оптимизации условий анализа. Для калибровки систем ELISA обратитесь к нашему руководству по эталону калибровки Aβ(1-42) для формулировок ELISA высокой чувствительности.
Полевые заметки о нестандартных параметрах: сдвиги вязкости и обработка кристаллизации при хранении Aβ(1-42) при субнулевых температурах
Хотя стандартное хранение при -80°C рекомендуется, мы столкнулись с двумя крайними случаями поведения, о которых стоит упомянуть. Во-первых, когда β-amyloid polypeptide 42 растворен в DMSO при концентрациях выше 5 мМ и хранится при -20°C, раствор может подвергнуться сдвигу вязкости, став гелеобразным. Это не указывает на деградацию, но может вызвать неточности при пипетировании. Мы рекомендуем кратковременное нагревание до комнатной температуры и вихревание перед использованием. Во-вторых, в некоторых буферных условиях (например, низкий pH, высокая концентрация пептида) Amyloid beta 42 может образовывать микрокристаллы при замораживании. Эти кристаллы повторно растворяются при оттаивании, но могут служить зародышевыми центрами агрегации. Для предотвращения этого мы быстро замораживаем аликвоты в жидком азоте и храним при -80°C. Если наблюдается кристаллизация, мы центрифугируем при 14 000g в течение 10 минут при 4°C и используем супернатант. Эти полевые заметки основаны на годах практической работы с этим пептидом и редко обсуждаются в стандартных протоколах.
Часто задаваемые вопросы
Какие существуют альтернативные методы мониторинга агрегации помимо ThT и конго красного?
Хотя флуоресценция ThT является рабочей лошадкой для HTS, она имеет ограничения: она может не обнаруживать мелкие олигомеры и может быть погашена некоторыми соединениями. Альтернативы включают динамическое светорассеяние (DLS) для распределения размеров, фотоиндуцированное сшивание немодифицированных белков (PICUP) в сочетании с SDS-PAGE для визуализации распределения олигомеров и точечные блот-анализы с олигомер-специфическими антителами, такими как A11. Для обнаружения без метки поверхностный плазмонный резонанс (SPR) может мониторить агрегацию в реальном времени. В нашем дрожжевом HTS мы используем функциональный выход — восстановление активности Sup35p, который напрямую сообщает о токсичности олигомеров, обходя необходимость связывания красителя.
Как вы управляете эффектами комплексообразования Cu²⁺ в анализах агрегации Aβ(1-42)?
Cu²⁺ связывается с N-концевым участком Aβ(1-42) (His6, His13, His14) и способствует образованию SDS-стабильных олигомеров. В HTS это может привести к ложноположительным результатам, если соединения хелатируют Cu²⁺, а не напрямую ингибируют агрегацию. Для контроля этого мы включаем условие без Cu²⁺ (с DTPA) и условие с добавлением Cu²⁺ (10 мкМ CuCl₂) в наш каскад валидации. Соединения, которые показывают активность только в условии с добавлением Cu²⁺, помечаются как потенциальные хелаторы металлов. Кроме того, мы используем масс-спектрометрию с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS) для измерения следовых металлов в наших партиях пептидов, обеспечивая, что они находятся ниже 1 ppm.
Как я могу стандартизировать in vitro кинетические протоколы для олигомеризации Aβ(1-42)?
Стандартизация начинается с самого пептида: всегда используйте одну и ту же партию Human Aβ42 для полной кампании скрининга. Мы рекомендуем следующее: (1) Мономеризуйте с HFIP и проводите ультразвуковую обработку, как описано выше. (2) Используйте определенный буфер (PBS + 10 мкМ DTPA, pH 7.4). (3) Включайте эталонный ингибитор на каждом планшету. (4) Используйте планшетный считыватель с контролируемой температурой (37°C) и встряхиванием (двойное орбитальное, амплитуда 1 мм). (5) Анализируйте данные, используя четырехпараметрическую логистическую аппроксимацию для определения IC₅₀. Соблюдая эти шаги, мы достигли межпланшетных CV менее 8% для конечных точек ThT.
Поставки и техническая поддержка
Как глобальный производитель, NINGBO INNO PHARMCHEM CO.,LTD. поставляет Aβ(1-42) в больших количествах с комплексной документацией. Наш пептид упакован в флаконы по 1 мг, 5 мг и 10 мг, при этом большие количества доступны по запросу. Для логистики мы используем бочки по 210 л для массовых растворителей и обеспечиваем холодовую цепь доставки для сохранения целостности пептида. Каждая отправка включает специфичный для партии сертификат анализа (COA), детализирующий чистоту, массу и остаточные растворители. Готовы оптимизировать вашу цепь поставок? Свяжитесь с нашей логистической командой сегодня для получения комплексных спецификаций и доступности тоннажа.